مقدمه:
قبل از استفاده از نمونه های RNA و DNA در تست های آزمایشگاهی، سنجش غلظت و خلوص آن ها امری الزامی می باشد. به طور معمول برای سنجش غلظت و خلوص نمونه های DNA و RNA می توان از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده کرد. اصول این تکنیک بر این اساس است که اسید های نوکلئیک دارای جذب (Absorbance) در طول موج 260 نانومتر می باشند. همچنین جذب در 260 نانومتر نسبت به 280 نانومتر (A260/A280) نیز به عنوان شاخص خلوص یک نمونه ی حاوی اسید های نوکلئیک مورد استفاده قرار می گیرد.
مواد و تجهیزات مورد نیاز:
- دستگاه اسپکتروفتومتر
- میکروپیپت
- سر سمپلر
روش کار:
ابتدا خوانش دستگاه اسپکتروفتومتر توسط حلال نمونه ی اسید نوکلئیک (بافر TE یا DEPC-treated water که به عنوان Blank در نظر گرفته می شود) صفر شده و سپس جذب نمونه ی رقیق شده ی مورد نظر در 260، 230 و 280 نانومتر خوانش می شود.
غلظت RNA و DNA توسط فرمول های زیر محاسبه می شود:
Double-stranded DNA: C (µg/ml) =A260×50
Single-stranded RNA: C (µg/ml): A260×40
برای محاسبه ی خلوص نمونه از A260/A280 استفاده می شود. برای نمونه های DNA نسبت 1.9-1.8 و برای نمونه های RNA نسبت 2-1.9 به عنوان نمونه ی خالص در نظر گرفته می شود. کاهش این نسبت به زیر 1.7 وجود آلودگی به خصوص پروتئین در نمونه را بیان می کند. همچنین نسبت A260/A230 نیز برای سنجش خلوص در نظر گرفته میشود. معمولا نمونه هایی با نسبت A260/230 بین 2.2-2 قابل قبول می باشند. کاهش این نسبت به معنای آلودگی با مواد آلی به خصوص فنول و کربوهیدرات می باشد.
مثال عملی:
| RNA | DNA | |
| 0.68 | .75 | A260 |
| 0.35 | 0.40 | A280 |
| 0.32 | 0.36 | A230 |
| 0.68×40= 27.2µg/ml | 0.75×50= 37.5µg/ml | Concentration |
| 0.68/0.35= 1.94 | 0.75/0.40= 1.87 | A260/A280 |
| 0.68/0.32= 2.1 | 0.75/0.36= 2 | A260/A230 |
