wound-healing assay یا scratch assay یکی از اولین روشهایی بود که برای مطالعه مهاجرت سلولی توسعه یافت و سرعت مهاجرت سلولها در تک لایه سلولی را برای پر کردن شکاف اندازه گیری میکند. این تکنیک به جهت بررسی سرعت و میزان مهاجرت و متاستاز سلول های سرطانی انجام میگیرد. در این تست پس از تشکیل تک لایه ای از سلول های سرطانی خراشی بر روی سلول ها ایجاد میشود و از محل خراش و در طول مهاجرت سلول برای بستن خراش تا زمانی که تماس های جدید سلول-سلول دوباره برقرار شود در ساعت های مشخصی توسط میکروسکوپ دوربین دارعکس برداری میشود. پس از تکمیل تست میزان مهاجرت و متاستاز سلول های سرطانی توسط نرم افزار های آماری آنالیز میشود. از این تست برای بررسی اثر دارو ها و مواد شیمیایی مختلف در جهت بررسی میزان مهار مهاجرت سلول های سرطانی استفاده میشود که میتواند تایید کننده اثر مثبت دارو در درمان سرطان باشد. این روش را می توان برای بررسی اثرات ماتریکس سلول و برهمکنش سلول-سلول بر مهاجرت سلولی استفاده کرد و با ترانسفکشن ترکیب شد تا تأثیر بیان ژن های برون زا بر مهاجرت تک تک سلول ها را تعیین کند.
پروتکل ها با توجه به نوع سلول مورد مطالعه می توانند متفاوت باشند. این تکنیک شامل مراحل اولیه قابل اجرا برای تقریباً همه انواع سلول است: 1) آماده سازی کشت سلولی. 2) ایجاد یک خراش نازک خطی “زخم” (ایجاد شکاف) در تک لایه سلولی. 3) اکتساب داده از طریق ثبت تصویر میکروسکوپی و اندازه گیری شکاف در هر نقطه زمانی. و 4) تجزیه و تحلیل داده ها.
آماده سازی کشت سلولی: تعداد سلول های مورد نیاز برای تشکیل یک تک لایه همرو باید با توجه به نوع سلول خاص و اندازه چاه ها تعیین شود. ظروف کشت را در داخل انکوباتور قرار دهید تا یک تک لایه سلول تشکیل شود.
ایجاد خراش : پس از ایجاد خراش، تک لایه سلول ها با محیط پایه شسته می شود تا بقایای سلولی از بین برود و محیط کامل اضافه می شود. سلولها در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 و 95 درصد هوا انکوبه می شوند.
اکتساب داده ها:
روش Snapshot: پیشرفت مهاجرت را می توان با گرفتن عکس های دیجیتال متوالی از شکاف با استفاده از میکروسکوپ میدان روشن ثبت کرد. یک رویکرد معقول این است که سه تصویر در هر چاه در هر نقطه زمانی ثبت کنید. سطح زخم را می توان با استفاده از نرم افزار ImageJ محاسبه کرد.
Live cell imaging: پلت فرمهای خودکار تصویربرداری سلول برای نظارت طولانی مدت رفتار سلول مناسب هستند زیرا میکروسکوپ را میتوان در داخل خود انکوباتور قرار داد. بنابراین سلول ها تحت شرایط فیزیولوژیکی بهینه برای مدت زمان آزمایش تصویربرداری می شوند. این سیستم امکان بازخوانی نقطه پایانی رویدادهای سلولی واندازه گیری جنبشی، عملکردی و کمی رفتار سلول های زنده را فراهم می کند.
تحلیل داده ها: نتایج بدست آمده از لحاظ آماری محاسبه می شوند. می توان از نمودار خطی برای رسم میانگین نرخ مهاجرت در مقابل زمان استفاده کرد.
:References
Liang CC, Park AY, Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature protocols. 2007 Feb;2(2):329-33.
Grada A, Otero-Vinas M, Prieto-Castrillo F, Obagi Z, Falanga V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. Journal of Investigative Dermatology. 2017 Feb 1;137(2):e11-6.
