سنجش غلظت پروتئین با روش BCA ASSAY
پروتئين ها، دسته‌اي بزرگ و ضروري از ماكروملكول‌هاي سلولي را تشكيل مي‌دهند. تعيين مقدار پروتئين نمونه‌هاي مختلف، در اغلب موارد، يكي از كارهاي ضروري، پيش از جداسازي و خالص‌سازي نمونه‌هاي مختلف مي‌باشد. اين سنجش، يك مرحله ضروري قبل از ارائه نمونه‌هاي پروتئيني مختلف براي انجام كروماتوگرافي، الكتروفورز و تفكيك و آناليزهاي بيشتر ايمونو شيمي مي‌باشد.
روش غلظت سنجی bicinchoninic acid (BCA) یک روش بیوشیمیایی برای تعیین غلظت کل پروتئین در محلول است (0.5 میکروگرم/میلی لیتر تا 1.5 میلی گرم در میلی لیتر) که اولین بار توسط اسمیت و همکارانش توصیف شد.
این روش شناخته شده باعث می‌شود، مس دو بار مثبت توسط پروتئین در یک محیط قلیایی و با حضور bicinchoninic acid، به مس یک بار مثبت تبدیل شود.
پیوندهای پپتیدی موجود در پروتئین، یونهای Cu2+ را از سولفات مس (II) به Cu1+ (واکنش وابسته به دما) کاهش می دهد. مقدار Cu2+ احیا شده متناسب با میزان پروتئین موجود در محلول است. این واکنش منجر به ایجاد رنگ بنفش با حداکثر جذب در 562 نانومتر می شود که توسط شلاته شدن دو مولکول bicinchoninic acid توسط یون مس ایجاد می‌شود. از آنجایی که تولید مس در این سنجش تابعی از غلظت پروتئین و زمان انکوباسیون است، محتوای پروتئین نمونه‌های ناشناخته را می‌توان به روش اسپکتروفتومتری با مقایسه با استانداردهای پروتئینی شناخته شده مانند آلبومین سرم گاوی BSA) ) تعیین کرد.
روش bicinchoninic acid (BCA) در مقایسه با روش های دیگراز جمله بردفورد مزایای زیادی دارد ، این روش از حساسیت بالایی برخوردار است (می تواند پروتئین ها را در غلظت های کم ug/mL 5 تشخیص دهد) و می توان از آن برای اندازه گیری طیف گسترده ای از غلظت پروتئین استفاده کرد.
مزیت دیگر سنجش BCA این است که به طور کلی تحمل مواد شوینده یونی و غیر یونی مانند NP-40 ، Triton X-100 که تمایل به ایجاد اختلال در سایر روش های سنجش پروتئین رنگی مانندLowry دارند را دارد. با این حال یکی از معایب سنجش BCA در مقایسه با روش برادفورد این است که مستعد تداخل برخی از مواد شیمیایی موجود در نمونه های پروتئینی از جمله عوامل کاهنده (به عنوان مثال، DTT و بتا-مرکاپتواتانول)، شلاتورهای مس (به عنوان مثال، EDTA، EGTA) و بافرها با غلظت بالا است که می توان با تولید نمونه های رقیق شده از آن جلوگیری کرد.
:References
He, F. (2011). BCA (Bicinchoninic Acid) Protein Assay. Bio-101: e44. DOI: 10.21769/BioProtoc.44
Walker, J.M. (2009). The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. In: Walker, J.M. (eds) The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. Humana Press, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-198-7_3
