فریز سلولی
رده های سلولی در کشت دائمی می توانند دچار جهش ژنتیکی، پیری و آلودگی میکروبی شوند. بنابراین، ذخیره سلول ها برای مطالعات آینده بسیار مهم است. انجماد تضمین می کند که در صورت آلودگی و از دست دادن منبع سلولی، سلول های پشتیبان داشته باشید. بهتر است سلولها را زمانی که در حداکثر سرعت رشد یا تقریباً به هم پیوسته هستند، انجماد کنیم.
روش انجماد عمومی برای سلولهای چسبنده و معلق یکسان است، با این تفاوت که سلولهای چسبنده باید قبل ازفریز از کف فلاسک کشت جدا شوند. بهترین روش برای محافظت از انجماد سلولهای كشت شده، ذخیره آنها در نیتروژن مایع در محیط كامل و با حضور ماده محافظت كننده ای مانند دی متیل سولفوكسید (DMSO) است.
- همیشه از محیط انجماد توصیه شده برای محافظت از سلول های خود استفاده کنید. محیط انجماد باید حاوی ماده محافظتی مانند DMSO یا گلیسرول باشد.
- DMSO (دی متیل سولفوکسید) یک حلالی آلی و قطبی است که به دلیل خاصیت نفوذ در غشاء و جابجایی آب، معمولاً به عنوان یک محافظ برودتی استفاده می شود. DMSO باعث کاهش دمای انجماد محیط می شود و خطر تشکیل کریستال یخ که می تواند به سلول ها آسیب برساند و باعث مرگ سلول ها شود را تا حد زیادی کاهش می دهد. باید توجه شود که برای انجماد سلولی حتما DMSO با گرید کشت سلولی، خلوص بالا و استریل استفاده شود. هنگام کار با این حلال حتما از دستکش استفاده کنید زیرا DMSO به راحتی از پوست دست جذب می شود و بسیار سمی است.
روش کار:
- در اولین مرحله فریز سلولی، محیط کشت داخل فلاسک را باید خارج نمایید. سپس با استفاده از PBS یا فسفات بافر سالین، فلاسک را شستشو دهید.
- برای رده های چسبنده، به منظور جداسازی سلول ها از فلاسک با تریپسین سلول ها را از کف جدا کرده و سوسپانسیون سلولی تهیه می کنید.
- در این مرحله فریز سلولی نوبت شمارش سلولی است. توجه کنید که درصد زنده ماندن سلول ها باید بیش از 90٪ باشد تا اطمینان حاصل شود که سلول ها به اندازه کافی برای انجماد سالم هستند. تعداد کل سلول ها و درصد زنده ماندن آنها را با استفاده از لام هموسیتومتر، شمارنده سلول و رنگ تریپان بلو شمارش کرده و حدود 1 الی 2 میلیون از سلول ها را جدا کنید.
- سلول های جدا شده را داخل کرایوتیوب منتقل کنید و به آن FBS و همچنین 10% (v/v) DMSO اضافه کنید و برای اطمینان از بدست آمدن مخلوط همگن، پیپتاژ انجام دهید.
- سلول ها را 1 الی 2 ساعت در فریزر ۲۰-، سپس یک روز در فریزر ۸۰- و بعد از آن به تانک ازت انتقال دهید.