مقدمه:
کیفیت کلی RNA را می توان با الکتروفورز روی ژل آگارز دناتوره کننده ارزیابی کرد. در این روش از ژل آگارز حاوی فرمالدهید استفاده می شود. اکثر RNAها از طریق جفت شدن بازهای درون مولکولی (Intramolecular base pairing) ساختار ثانویه گسترده ای را تشکیل می دهند و به همین جهت مهاجرت آن ها بر روی ژل آگارز مطابق با اندازه حقیقی آن ها صورت نمی پذیرد. فرمالدئید حاوی یک گروه کربونیل است که با گروه های ایمین یا آمین بازهای گوانین، آدنین و سیتوزین برای تشکیل شیف بیس ها (Schiff base) واکنش می دهد و از جفت شدن بازهای درون مولکولی جلوگیری می کند و در نتیجه RNA را در فرم دناتوره حفظ می کند.
مواد و تجهیزات مورد نیاز:
-
آگارز
-
بافر 10x MOPS (0.4 M MOPS* pH 7، 0.1 M sodium acetate، 0.01 M EDTA)
-
Tracking dye
-
Sample buffer
-
Ethidium bromide
-
دستگاه الکتروفورز افقی
-
دستگاه Gel documentation
*3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)
روش کار:
نکته: نسبت به قالب ژل الکتروفورز مورد استفاده می توان حجم محلول ها را به نسبت یکسان تغییر داد.
-
1 گرم آگارز را در 72 میلی لیتر آب در ارلن مایر حل کنید و سپس ارلن را حرارت دهید تا محلول به جوش آید. به محض شفاف شدن، آن را از روی حرارت برداشته و سپس اجازه دهید تا دمای محلول به 65 درجه ی سانتی گراد برسد.
-
10 میلی بافر MOPS 10x و 18 میلی لیتر فرمالدهید 37 درصد را به ارلن مایر حاوی آگارز اضافه کنید.
-
محلول تهیه شده را به قالب ژل مخصوص الکتروفورز افقی اضافه کرده و شانه (comb) را در جایگاه خود قرار می دهیم تا ژل شکل گیرد.
-
پس از سرد شدن و شکل گیری کامل ژل، ژل را همراه با قالب به تانک الکتروفورز حاوی بافر MOPS 1x منتقل کرده و پس از آن که از غوطه ور شدن کامل ژل در بافر اطمینان حاصل کردیم، شانه را به آرامی خارج می کنیم
-
4.7 میکرولیتر از نمونه ی RNA را با به یک میکروتیوب منتقل کرده و به آن 11.3 میکرولیتر sample buffer اضافه کرده و سپس 5 دقیقه در 60 درجه ی سانتی گراد حرارت داده و سپس نمونه را بر روی یخ قرار می دهیم.
-
4 میکرولیتر Tracking dye به نمونه اضافه کرده (حجم نهایی 20 میکرولیتر می شود) و سپس کل نمونه را روی ژل بارگذاری می کنیم.
-
الکتروفورز را در دمای اتاق در ولتاژ پایین (4-5 V/cm) ولت تا زمانی که tracking dye (بروموفنول بلو) 2/3 از طول ژل را طی کند انجام می دهیم.
-
پس از پایان الکتروفورز، ژل را توسط اتیدیوم برماید (10mg/mL) رنگ آمیزی کرده و سپس توسط نور UV یا دستگاه Gel documentation خوانش ژل انجام می شود.
روش تهیه ی Sample buffer مقدار مواد لازم 660µL Ultrapure formamide 200µL MOPS buffer (10x) 270µL Formaldehyde 1.13ml Total روش تهیه ی Tracking dye مقدار مواد لازم 150mg Ficoll 400 100µL MOPS buffer (10×) 200µL-1mL Bromophenol blue (1%) H2O :Reference
Sambrook J, Russell DW. Separation of RNA According to Size: Electrophoresis of RNA through Agarose Gels Containing Formaldehyde. CSH Protoc. 2006 Jun 1;2006(1):pdb.prot4050. doi: 10.1101/pdb.prot4050. PMID: 224856=466
