Real time PCR چیست؟
واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (Real time PCR) ، که همچنین به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (qPCR) شناخته می شود ، یک روش آزمایشگاهی زیست شناسی مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است.
اساس PCR همانندسازی توالی خاصی بوده و در روش PCR با استفاده از اجزای همانند سازی ناحیه خاصی از مولکول DNA الگو بوسیله آنزیم DNA پلیمراز در لوله آزمایش تکثیر میشود. dNTPها بعنوان واحدهای ساختمانی جهت سنتز رشته جدید استفاده می‌شوند. پرایمرها که قطعات اولیگو نوکلئوتیدی هستند بر اساس قوانین کلی جفت شدن بازها به DNA الگو متصل می‌شوند و از روی DNA الگو سنتز رشته‌های جدید صورت می‌گیرد و در هر مرحله محصول DNA بصورت تصاعدی افزایش پیدا میکند.
مزایای Real time PCR:
- مزیت Real time PCR نسبت به سایر روش‌های PCR این است که میزان محصول در هر چرخه قابل ردیابی است و می‌توان به صورت کمی میزان تکثیر را بررسی نموده و میزان الگوی اولیه را دقیقاً تخمین زد. اساس این روش سنجش کمی نسخههای ژنی از طریق سنجش میزان نشر نور فلورسنت در مرحله تصاعدی از واکنش PCR است. درPCR Real time از یک نشانگر فلورسنت استفاده میشود که این نشانگر به گونه‌ای طراحی شده است که در صورت تکثیر محصول نور تولید کند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. معمولاً اگر واکنش بهینه شده باشد در 3 تا 15 چرخۀ ابتدایی تغییر چندانی در شدت فلورسنت دیده نمی‌شود که پیام بصورت نویز می‌باشد، که به این منطقه خط پایه (Baseline )می گویند.
انواع Real time PCR:
- Real time PCR بطور کلی به دو روش اختصاصی و غیر اختصاصی تقسیم میگردد. در گروه اختصاصی از پروب ویژه جهت اتصال به قطعاتی از ژن هدف استفاده میشود. اما در گروه غیر اختصاصی از یک رنگ فلورسنت ویژه متصل شونده به DNA نظیر سایبرگرین استفاده میشود که تنها پس از اتصال به DNA دو رشتهای، نور فلورسنت قوی منتشر میکند. طول موج جذب نور سایبرگرین nm 470 و طول موج نشر فلورسنت آن nm 510 می‌باشد که در دمای حدود °C 60 تابش و اندازه‌گیری نشر فلورسانس انجام می‌گیرد. این رنگ طی واکنش متناسب با میزان محصولات تولید شده از هر چرخه نور فلورسنت ساطع شده و میزان نشر فلورسانس آن توسط نمایانگر دستگاه شناسایی و ثبت میگردد. در ادامه شدت فلورسنت رو به افزایش گذاشته و به اولین چرخه‌هایی که شدت فلورسنت بصورت معنا داری از خط پایه بیشتر شود چرخۀ آستانه یا Ct گویند. عدد Ct با مقدار الگوی اولیه تناسب داشته و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. داده‌های اولیه حاصل از واکنش Real-time PCR میتوانند با استفاده از روش مقایسه سیکل آستانه بررسی شوند.
منحنی ذوب:
برای اطمینان از صحت و اختصاصی بودن محصولات تولید شده از منحنی ذوب استفاده می شود. به این ترتیب که از دمای پایین تر از دمای اتصال تا دمای بالاتراز ۹۵ درجه سانتی گراد را در نظر گرفته وبرنامه مربوط به آن را به دستگاه می دهیم، تا به ازای هر نیم درجه سانتی گراد لامپ روشن شود و شدت جذب فلورسنت را بخواند. این مهم باعث می شود که برای تمام قطعات تکثیر شده پیک جذب رسم شود. وجود تنها یک نمودار با یک قله تیز نشان از وجود تنها یک محصول اختصاصی دارد و در صورت وجود آلودگی از طریق پیک جذب آن را شناسایی می کنیم. در دمایی پایین پیک های که رسم می شود مربوط به پرایمر دایمر است و آخرین پیک مربوط به قطعه موردنظر ما می باشد.
مراحل Real time PCR:
سه مرحله اصلی در هر چرخه Real time PCR وجود دارد و واکنش ها معمولاً برای 40 سیکل اجرا می شوند. مرحله اول Denaturation ، در حدود 95 درجه سانتیگراد ، اجازه می دهد تا زنجیره دوتایی اسید نوکلئیک جدا شود. مرحله دوم Annealing ، در دمای حدود 50-60 درجه سانتیگراد ، اتصال پرایمرها با الگوی DNA را امکان پذیر می کند. مرحله سوم Extension ، در دمای 68-72 درجه سانتیگراد ، پلیمریزاسیون انجام شده توسط DNA پلیمراز را تسهیل می کند.
:References
https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-update-flr.pdf
