سنتز cDNA (نسخه برداری معکوس از RNA)
RNA را نمی توان مانند DNA تکثیر کرد. با این حال، می توان آن را به DNA مکمل یا همان (Complementary DNA) که موسوم به cDNA است تبدیل کرد که می تواند مانند هر توالی DNA دیگری تقویت شود. این فرآیند به پرایمر مکمل توالی RNA هدف، آنزیمی به نام ترانس کریپتاز معکوس، دئوکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) ، بافر واکنش، مهارکننده RNase و آب بدون RNase نیاز دارد. این فرآیند رونویسی معکوس نیز نامیده می شود. پس از سنتز cDNA امکان آنالیز کمی میزان بیان ژن مربوطه توسط واکنش های Real-Time PCR فراهم می‌گردد.
cDNA ممکن است توسط هر یک از سه پرایمر زیر سنتز شود:
- پرایمر اختصاصی ژن
- Random hexamer
- Oligo(dt)
- پرایمرهای اختصاصی ژن، مکمل خود هدف هستند. جهت سنتز cDNA برای دیگر RNAها مانند microRNA از پرایمرهای اختصاصی مانند stem-loop استفاده میشود. به دلیل قابلیت ایجاد یک ساختار سنجاق سری یا hairpin باعث اتصال و شناسایی اختصاصی microRNA ها میشود.
- پرایمر Random hexamer به صورت توالی های 6 نوکلئوتیدی تصادفی طراحی شده که به صورت تصادفی به نقاط مختلف RNA متصل می شود. اینها زمانی مفید هستند که فقط قسمتهای کوچکی از cDNA یا cDNAهای هدف چندگانه سنتز شوند
- از پرایمر Oligo(dt) جهت سنتز cDNA از روی mRNA استفاده می شود. این پرایمر به دلیل داشتن توالی غنی از نوکلئوتید تیمین و در نتیجه مکمل بودن با انتهای رشته mRNA، به دم پلی A انتهای mRNA متصل می شود. از آنجایی که mRNA تنها 1-2٪ از کل RNA را تشکیل می دهد، بازده cDNA از الیگو dT کم است.
واکنش‌های رونویسی معکوس به سه فرآیند اصلی نیاز دارند:
پلیمریزاسیون DNA ، اتصال پرایمر و همچنین فعال‌سازی آنزیم.
زمان و دمای این مراحل بر اساس پرایمر مورد استفاده، ترانس کریپتاز معکوس هدف و هدف مورد استفاده متفاوت است.
مرحله مهم پلیمریزاسیون DNA است. در این فرآیند، مدت و دمای واکنش ممکن است بر اساس انتخاب پرایمر و ترانس کریپتاز معکوس مورد استفاده متفاوت باشد.
مراحل مشترک در کیت های سنتز cDNA مختلف:
افزایش دما تا 65 درجه برای باز شدن پیچ و تاب ها و ساختار های ثانویه RNA. در نهایت نمونه ها با سرعت به دستگاه ترمال سایکلر منتقل می گردد و نمونه به ترتیب در سه دمای مختلف قرار می گیرد. دمای اول که 55 درجه سانتی گراد است، جهت اتصال پرایمر، سپس اتصال آنزیم و سنتز cDNA می باشد. دمای دوم که 80-70 درجه سانتی گراد است، جهت غیر فعال کردن آنزیم بوده و دمای سوم جهت خنک کردن نمونه می باشد. پس از اتمام واکنش، نمونه ها به فریز منفی 20 درجه سانتی گراد متقل شده و در آنجا نگهداری می شوند.
